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介紹：瓊脂糖是由1,3連結(jié)的β-D-半乳呋喃糖和1,4連結(jié)的3,6脫水a--半乳呋喃糖相間聯(lián)結(jié)而成。瓊脂糖具有親水性,并幾乎完全不存在帶電基團(tuán),極少吸附生物大分子也極少引起其變性,是理想的惰性載體。瓊脂糖在水中一般加熱到90℃以上溶解,溫度下降到35-40℃形成良好的半固體狀的凝膠。瓊脂糖凝

膠是最常用的分離介質(zhì),用作電泳和層析載體,分離生物大分子(核酸、蛋白、多糖等)。

瓊脂糖凝膠的優(yōu)點(diǎn):

1、樣品無需預(yù)處理,電泳操作簡單,電泳速度快。

2、凝膠結(jié)構(gòu)均勻,電泳圖譜清晰,分辨率高,重復(fù)性好

3、凝膠透明無紫外吸收,電泳結(jié)果可直接用紫外光燈下監(jiān)測。

4、易染色,樣品易洗脫,便于定量測定。制成干膜可長期保存。

瓊脂糖凝膠的制備方法

1、根據(jù)電泳需要,配制電泳緩沖液。

2、準(zhǔn)確稱量的瓊脂糖加入三角瓶,加入電泳液(1%瓊脂糖凝膠,即為1g瓊脂糖,加入100m11×TAE)。

總液體量不宜超過三角瓶的50%容積

3、微波爐高火加熱至沸騰,保持30秒,戴上防熱手套,小心搖動三角瓶,重懸未溶解顆粒,再次高火加

熱1-2分鐘,直至瓊脂糖完全溶解。

注:加熱時(shí)如膠液劇烈沸騰發(fā)泡,停止加熱。微波爐中加熱時(shí)間不宜過長。

4、溶液冷卻至60℃左右,可加入EB溶液(終濃度為0.5ug/m1,其它核酸染料也可),并充分混勻。

5、將瓊脂糖溶液倒入制膠模中,在適當(dāng)位置插上梳子。凝膠厚度一般在3-5mm之間。

6、室溫下自然凝固(約30-60分鐘),然后放置于電泳槽中進(jìn)行電泳。

注:凝膠不立即使用,用保鮮膜將凝膠包好后在4℃保存,可保存2-5天。

瓊脂糖濃度與DNA分高范圍

常見問題及解決辦法

微波爐溶解瓊脂糖時(shí),膠液劇烈沸騰沖溢出三角錐瓶怎么辦?

1、總液體量不宜超過三角錐瓶的50%容量。

2、膠液濃度為2%以上的請?jiān)O(shè)置中火加熱。

3、膠液劇烈沸騰時(shí),停止加熱,戴上防熱手套小心搖動三角瓶,然后再次加熱至沸騰,直至瓊脂糖完全溶解膠液清澈。

瓊脂糖電泳圖像背景模糊的原因及解決辦法

瓊脂糖沒有完全溶解會造成電泳圖像背景模糊不清。完全溶解的瓊脂糖,三角瓶內(nèi)壁應(yīng)沒有粘附瓊脂糖顆粒

DNA條帶模糊,拖尾的原因及解決辦法

1、DNA降解。樣品應(yīng)避免放置時(shí)間過長,避免核酸酶污染。

2、上樣量過多。減少上樣量。

3、電泳緩沖液失效。多次使用的電泳緩沖液,離子強(qiáng)度降低,值上升,緩沖能力減弱,影響電泳效果。

建議更換電泳緩沖液

4、電泳條件不合適。電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過20V/cm,溫度<30℃,超長DNA鏈,溫度應(yīng)<15℃

5、DNA含鹽過高。電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽。

6、蛋白污染。電泳前抽提去除蛋白。

7、DNA變性。電泳前勿加熱,用20 mM NaCl緩沖液稀釋DNA。

DNA條帶淡弱或無條帶的原因及解決辦法

上樣量不夠。增加上樣量

2、DNA降解。避免DNA的核酸酶污染。

3、DNA跑出凝膠?？s短電泳時(shí)間,降低電壓,增強(qiáng)凝膠濃度。

4、分子大小相近的DNA條帶不易分辨,增加電泳時(shí)間,使用正確的凝膠濃度。

5、DNA變性。電泳前請勿高溫加熱DNA鏈,用20 mM NaCl Buffer稀釋DNA

6、DNA鏈超長,常規(guī)凝膠電泳不合適。在脈沖凝膠電泳上分析。

DNA Marker條帶扭曲的原因及解決辦法

1、配制凝膠的緩沖液和電泳的緩沖液,不是同時(shí)配制的。使用同時(shí)配制的緩沖液,緩沖液高過凝膠1-2m。

2、電泳時(shí)電壓過高。可以在電泳前15分鐘用較低電壓(3V/cm),等條帶出孔后,再調(diào)高電壓。

3、盡量慢慢加樣,等樣品自然沉降后再加電壓。

外觀：白色粉末

敏感性：易吸潮

儲存條件：RT

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